CRISPR KO Cell Line案例研究

• 案例分享1
  • 在4号外显子中通过插入缺失，敲除人类结肠癌细胞HCT116中的K-ras位点，如图1所示。
  • 对Cas9和gRNA递送颗粒进行慢病毒包装，HCT116细胞进行病毒滴度优化。对每个单克隆进行Sanger测序，选择K-ras基因在第4号外显子上敲除的纯合子，如图2所示。
  • 通过Western Blot方法验证所选克隆中K-ras基因表达缺失，如图3所示。

  

  图1：K-ras敲除方法

  

  图2：亲代细胞和K-ras-/-HCT116细胞sanger测序

  

  图3：K-ras敲除蛋白表达验证

• 案例分享2
  • 设计并合成gRNA，以靶向GS等位基因上的特定区域。用该载体转染DG44细胞，并通过Sanger测序分析细胞池。
  • 获得了几个单克隆并进行Sanger序列分析。一个单克隆包含移码突变（图1）。
  • 分析GS敲除克隆的GS蛋白表达（图2）。
  • 为了评估功能丧失，在有或没有谷氨酰胺浓度增加的情况下培养GS敲除克隆（图3）。在没有谷氨酰胺的情况下GS敲除克隆不能生长。在增加谷氨酰胺时GS敲除克隆生长，因此确定GS敲除细胞系的功能缺失。
  • 总之，成功靶向GS产生的单克隆已完全验证GS功能的缺失。

  

  图1：GS等位基因缺失引起移码突变

  

  图2：在GS敲除细胞裂解液中，anti-GS抗体未检测到谷氨酰胺合成酶

  

  图3：DG44(GS-/-)的L-谷氨酰胺依赖性

• 案例分享3
  • 设计一对gRNA靶定基因组上的基因进行全基因缺失。使用GenCRISPR™技术优化gRNA对，对Jurkat细胞的切割效率最大（图1）。
  • 配对的gRNAs共转染到Jurkat细胞中，并通过FACS分选富集。通过PCR评估缺失效率，根据条带灰度计算，转染细胞池占21%（图2）。
  • 采用高通量PCR方法筛选到了200个单克隆，并通过Sanger测序和RT-PCR验证全等位基因缺失克隆（图3）。

  

  图1：

  

  图2：PCR验证gRNA对

  

  图3：缺失克隆筛选