如何制备高质量质粒？

GenScript的行业经验教你如何制备高质量质粒

从细菌培养物中制备质粒通常涉及两个步骤：细菌的裂解和质粒DNA的纯化。碱裂解是用于小规模制备的细胞裂解常用的方法。但是质粒DNA纯化步骤有多种方法，这些方法各有优缺点，可能会影响下游分子生物学的应用。

细胞裂解和中和后，少量体积较大的超螺旋染色体DNA与变性的细胞蛋白会一起从溶液中沉淀出来，而质粒仍然存在在溶液中，然后通过离心或过滤就可以容易地将沉淀物与质粒DNA溶液分离。但此时质粒DNA仍与残留的细胞蛋白和碎片，盐，EDTA和RNase混合。

因此，需要后续的纯化步骤将其他杂质从质粒DNA中去除。常用的纯化方法有如下三种：

苯酚-氯仿萃取法

苯酚/氯仿混合物会溶解蛋白质和脂质污染物，而核酸会留在水相中。但是在终样品中可能会有苯酚或氯仿的残留，这会抑制下游的酶促反应。此外，氯仿和苯酚对人体有害。因此，工业生产较少使用该方法。

乙醇沉淀法

乙醇沉淀是脱盐和浓缩DNA的常用方法。乙醇可以改变DNA的结构，从而使DNA从溶液中沉淀出来，去掉可溶性的盐和有机小分子后，重新悬浮沉淀的质粒DNA。乙醇沉淀的方法既便宜又有效，但也会沉淀RNA和ssDNA碎片。

核酸纯化柱（Spin Column) 分离法

核酸在某些条件下会与固相二氧化硅相结合，改变条件可以洗脱纯化核酸，该方法通常用于质粒微量制备试剂盒。这种方法既方便又快捷，但成本较高。

乙醇沉淀和旋转柱是基因合成和克隆行业中常用的方法。更多的供应商使用乙醇沉淀法，因为它成本较低。

分子生物学服务

质粒质量测试

为了了解用两种不同方法制备的质粒DNA的质量和产量，我们从不同方面对质粒进行了测试。

通过使用Nanodrop进行定量，我们发现核酸纯化柱制备的质粒的浓度通常低于乙醇沉淀法制备的浓度。对于低拷贝数的质粒，二者的差异更大。

是因为核酸纯化柱法的产率较低还是用Nanodrop测量的DNA浓度不准确？Nanodrop是紫外分光光度计，通过260 nm的吸光度测量DNA浓度。但是有太多其他物质在260 nm处吸收，因此测量不是特定的。

另一种DNA定量常用方法是Qubit分析，Qubit法是基于荧光染料的化学性质来分析。荧光染料可与DNA分子特异性结合，因此即使对于受污染的样品，Qubit 也可以确定真实的DNA浓度。

我们用Nanodrop和Qubit系统测量了DNA浓度，发现由Nanodrop确定的质粒浓度通常高于Qubit。对于乙醇沉淀法制备的质粒，这两种方法之间的差异更大。另外，使用乙醇沉淀法和核酸纯化柱制备后，Qubit显示质粒的浓度非常相似。这些结果表明核酸纯化柱制备的质粒总收率与乙醇沉淀的水平相同，但核酸纯化柱制备的质粒污染更少。

质粒的纯度会影响下游克隆反应，为了进一步验证核酸纯化柱制备的质粒是否比乙醇沉淀更清洁，我们将质粒用于制备克隆的线性化载体。我们将制备的质粒和凝胶纯化的DNA两次消化相同量（Nanodrop浓度）。我们发现用核酸纯化柱制备的质粒比乙醇沉淀产生的线性化质粒浓度高得多。这进一步表明，用核酸纯化柱制备的质粒含有较少的污染物。

我们将等量的（ Nanodrop法定量）质粒DNA直接转化到大肠杆菌感受态细胞中。核酸纯化柱制备的质粒产生了更多的菌落，进一步表明核酸纯化柱制备的DNA含有更多的目的质粒DNA分子。

总之，用核酸纯化柱制备的质粒比乙醇沉淀更干净，更适合克隆和转化反应。